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技術文章

病毒濃縮 | Amicon® Ultra超濾管應用方案

更新時間:2024-01-04 瀏覽次數:306

2023
基 因 治 療

基因治療是通過將特定的細胞功能改變的遺傳物質引入患者來治療遺傳疾病。根據給藥的方式可以分為:體內基因治療(invivo)和體外基因治療(invitro)。


  • 體內基因治療指將攜帶治療性轉基因的載體直接注入患者體內。

  • 體外基因治療包括從患者的細胞或異體來源提取細胞,通過攜帶治療性轉基因的載體進行基因修飾,再將該工程細胞重新導入患者體內。


基因治療的關鍵步驟是如何有效地通過遞送載體將基因傳遞到目標組織/細胞。根據載體的屬性分為:病毒類遞送載體和非病毒類遞送載體。不同細胞類型的轉染效率差異很大。因此,已經開發了多種病毒來源的載體系統,用于改善哺乳動物細胞中的cDNA轉導、表達和篩選。這些系統包括COS細胞中的猿病毒40復制子(SV40)以及源自逆轉錄病毒、桿狀病毒、甲病毒、人類免疫缺陷病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)的cDNA克隆和表達載體。以逆轉錄病毒、腺病毒(Ads)或腺相關病毒(AAVs)的使用最為廣泛。


在臨床試驗中使用病毒載體相關的挑戰包括生產足夠數量的臨床級材料和維持病毒載體的生物安全性。病毒載體的生產和純化在方法和病毒產量和質量方面各不相同。病毒載體的生成和純化是勞動密集型的且昂貴的,并且可能需要特殊設備(如超速離心機)。純化腺病毒、慢病毒和AAV的標準方法是使用密度梯度超速離心,然后進行長時間透析。近年來柱或膜層析已成為腺病毒純化的方法。病毒的產量通常通過空斑試驗、TCID50測定和ELISA來確定。對于大多數應用,重組病毒必須純化至高滴度。為了獲得高滴度原液,通常需要濃縮純化的病毒顆粒。


之前我們有文章介紹了使用默克Amicon®Ultra超濾管分離提取外泌體,今天給大家介紹超濾管的其它應用-濃縮病毒!下面介紹使用Amicon®Ultra離心超濾裝置濃縮三種常見的病毒類型:慢病毒,腺病毒和腺相關病毒(AAV)。


01
實驗步驟 


01
包裝細胞

宿主細胞鋪板以達到80-85%的匯合度。

02
轉染

細胞轉染重組質?;蚋腥净畈《绢w粒。

03
收獲病毒

根據病毒的不同,使用細胞上清液或沉淀細胞或兩者兼而有之來純化重組病毒粒子。通常應用三到四輪凍融循環從細胞中釋放病毒。然后通過離心或預過濾將細胞碎片與細胞裂解物分離。

04
病毒純化

通過密度梯度超速離心或柱/膜層析從細胞裂解物中純化病毒。在某些情況下可以使用肝素或粘蛋白瓊脂糖的親和色譜。然后將純化的病毒溶液通過透析或滲濾完成將緩沖液置換成適當的儲存溶液。

05
病毒濃縮

為了獲得高滴度的病毒原液,可以使用離心超濾濃縮純化的病毒。


備注:正確選擇設備、膜材料、MWCO、離心速度、離心時間和緩沖液組成對于感染性病毒顆粒的高回收率至關重要。


Amicon®Ultra超濾管采用50KDa NMWL Ultracel® 再生纖維素膜,已被證明可以成功濃縮腺病毒和AAV溶液。對于慢病毒濃度,可以使用50KDa和100kDa膜的超濾管。


02
實驗結果 


下表顯示了粗制細胞裂解物和色譜純化的病毒中腺病毒、慢病毒和AAV濃度的典型結果。


表1:采用Millipore®超濾產品濃縮病毒


特別注意

①我們不建議將病毒濃縮到超過1013顆粒/mL的濃度,以避免可能出現的病毒聚集。


②大多數病毒不能有效地濃縮并儲存在低鹽緩沖液中。病毒在濃度為<250mM鹽濃度的溶液中離心將導致病毒聚集和傳染性降低。推薦儲存溶液配方是:20mMTris、pH8.0、250mMNaCl、5%山梨糖醇和0.001%PF68(多聚糖酸)。


濃縮的病毒原液也可以通過0.22μm過濾器進行過濾滅菌。例如,無菌Steriflip-GP®過濾裝置(目錄號SCGP00525)可用于50mL或以下的體積或Ultrafree®MCGV(目錄號UFC30GV0S)可用于體積<0.5mL的樣品。對于較大體積的樣品,則可使用70%消毒處理過的Amicon®Ultra或Centricon®Plus70超濾管濃縮。


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